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致力于生命研究、生物檢測技術的多領域開發(fā)
基因克隆(gene cloning)是將提取或合成的目的基因,與具有自主復制能力的載體(vector)基因拼接重組,并導入受體細胞進行無性繁殖從而形成新的基因分子的過程。
自上世紀七十年代創(chuàng)建第一個重組DNA分子克隆以來,基因克隆成為分子生物學的核心技術,促進了生物分子學進步,也有力推動了生物醫(yī)學研究和產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。
基因克隆技術首先有助于精準分析目的基因的表達與調(diào)控、蛋白相互作用,包括調(diào)控元件、轉錄因子研究以及非編碼RNA研究等;其次,可以用于難以獲取的天然蛋白的大規(guī)模生產(chǎn);然后,可用于定型改造生物基因組結構,使之具有更大應用前景。此外,近年來隨著基因測序與分析需求的增長和新一代測序技術(NGS)的發(fā)展,基因克隆技術也發(fā)揮著日益重要的作用。
根據(jù)基因克隆的類型,可以分為以下三大類:
一、經(jīng)典基因克隆,需要限制性內(nèi)切酶和連接酶。這也是目前應用最為廣泛的基因克隆手段,具有操作簡便的特點,但受制于限制性內(nèi)切酶酶切位點和連接酶效率,一般適合于小片段基因克隆。
二、需要修飾酶的基因克隆,不需要限制性內(nèi)切酶和連接酶,提高了基因克隆的靈活性和應用空間,如UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)克隆法,具有操作簡單、克隆效率高的特點。
三、需要重組酶的基因克隆,利用重組酶及其特異識別位點,實現(xiàn)快速、高效的靶向克隆,不僅可實現(xiàn)高通量克隆,還可適合于原核生物、酵母、昆蟲細胞及哺乳動物細胞等多系統(tǒng)的表達載體。目前,基于重組酶的基因克隆技術,如GateWay技術和Golden Gate技術等得到普遍關注。
經(jīng)典的基因克隆方法主要包括:目的基因制備、限制性內(nèi)切酶消化切割目的基因和載體、用DNA連接酶連接酶切后的基因和載體,制備DNA重組體;將DNA重組體導入宿主細胞、篩選克隆及鑒定以及目的基因在宿主細胞中的擴增和表達等步驟。
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